Экспериментальная оценка криосохраненных аллографтов


Современная сердечно-сосудистая хирургия невозможна без использования протезов клапанов сердца: механические, биологические (ксенографты) и аллографты.

После сердечной недостаточности тромбоэмболия является ведущей причиной смерти при аортальном протезировании. Частота антикоагуляционных осложнений составляет около 5% в год.

Скорость кальцификационной дегенерации ксенографтов у лиц молодого возраста довольно высока, и большинство кардиохирургов старается имплантировать их пациентам старше 60 лет.

Клапанное протезирование у детей представляет значительные сложности. Механические клапаны ассоциируются с антикоагуляционными осложнениями и гемодинамической дисфункцией. Попытки использования ксенографтов у детей предпринимаются во избежание антикоагулянтной терапии. Они не нашли широкого применения из-за большой частоты ранней послеоперационной недостаточности и последующей кальцификации. Ограниченный размер клапанного кольца и неудобство в этом плане биопротеза вызывает необходимость увеличения корня аорты и имплантации большого механического протеза детям с аортальным стенозом.

Аллографты имеют следующие преимущества:

  1. лучшие гидравлические характеристики с центральным необструктивным током;
  2. снижение риска тромбоэмболических и гемолитических осложнений;
  3. повышенная резистентность к инфекционному эндокардиту;
  4. приемлемый срок эксплуатации;
  5. редкое поражение кальцинозом створок клапана.

Иммунный ответ не играет роли в повреждении створок, хотя этот механизм, возможно, влияет на развитие кальцификации стенки аллографта.

Применение аллографтов в кардиохирургии связано с разработкой метода криоконсервации, который обеспечивает длительное сохранение жизнеспособности клеток и позволяет создать банк аллографтов, что особенно важно для новорожденных и детей младшего возраста.

В литературе имеются описания ультраструктуры криосохраненных аллографтов в эксперименте и клинической практике, однако они касаются, прежде всего, гистохимических процессов в аллографте и состояния его эндотелия. Практически не изучены изменения в средней оболочке стенки аллографта, а также в его субэндотелиальном слое. Однако они представляют интерес вследствие влияния на способ кровоснабжения аллографта в организме реципиента.

Целью исследования явилась оценка изменений ультраструктуры средней оболочки и субэндотелиального слоя аллографта после криоконсервации, а также в отдаленные сроки после его имплантации в эксперименте.

Материалы и методы

Приготовление аллографта производилось по следующей методике: после забора он стерилизовался в течение 24 ч при температуре 4 °С в питательной среде RPMI1640 Hepes Modification, содержащей антибиотики (цефазолин, метронидазол, гентамицин). Замораживание аллографта осуществлялось в стерильном контейнере в питательной среде RPMI 1640 Hepes Modification, содержащей криопротектант - 10%-й диметилсульфоксид, по специальной программе до температуры -80 °С. Далее контейнер помещался в жидкий азот и хранился при температуре -190-196 °С от 3-х месяцев до 2-х лет. Размораживание аллографта производилось также по специальной программе с последующим отмыванием в растворах питательной среды с убывающей концентрацией диметилсульфоксида.

Криосохраненные аллографты были имплантированы в эксперименте 40 собакам (в аорту в инфраренальную позицию). Животные выводились из эксперимента через 1 (n = 20) и 2 (n = 20) года после операции.

Аллографты после криоконсервации и в эксперименте исследовались методом световой и электронной микроскопии.

Результаты и обсуждение

По данным световой микроскопии аллографтов после их крио-сохранения установлено следующее: в 100% случаев (n = 40) очагово-подэпителиальный слой и средняя оболочка имеют разрыхленный вид за счет набухания и разволокнения эластических мембран с нарушением их упорядоченной ориентации, а также заметного расширения (в средней оболочке) щелевидных сосудов, набухания и деструктуризации межфибриллярного основного вещества (субэндотелиальный слой) и коллагеновых волокон. В 15 случаях (34,9%) обнаруживались немногочисленные набухшие гомогенные безъядерные эндотелиоциты, а также очаговая фрагментация базальной мембраны. Изменения в стенке крио-сохраненных аортальных аллографтов после 1-го и 2-х лет имплантации in vivo не имели существенных различий. В 40 случаях (100%) отмечено заметное утолщение субэндотелиального слоя, гомогенизация межфибриллярного основного вещества, набухание клеточных компонентов средней оболочки с мелкоглыбчатым распадом ядер миоцитов или их гиперхромией, а также обилие щелевидных сосудов. В 18 наблюдениях (45%) обнаруживались очаги дистрофии фибриллярных структур субэндотелиального слоя. В 37 случаях (92,5%) выявлялись участки гомогенизации и снижения интенсивности окраски средней оболочки с «затушевыванием» эластических мембран.

По данным электронной микроскопии, существенных различий в ультраструктуре стенки всех графтов, хранившихся в различные сроки, не обнаружено.

В средней оболочке аорты сохраняются окончатые эластические мембраны и гладкие мышечные клетки, а также их контакты; в миоцитах - обычная структура цитоплазматических органелл: ядро, митохондрии, миофибриллы, рибосомы (рис. 1).

электронограмма средней оболочки аллографта после криоконсервации и после 12 месяцев имплантации

Таким образом, криоконсервация аллографтов незначительно влияет на их ультраструктуру, не вызывая выраженных изменений независимо от длительности пребывания ткани при температуре жидкого азота.

В средней оболочке аллографта через 1 год после имплантации в 100% случаев (n = 20) уменьшается количество гладкомышечных клеток и значительно гипертрофируются сохранившиеся миоциты (рис. 2). В 90% наблюдений (n = 18) пространство между ними заполняется эластическими и коллагеновыми волокнами. Среди них встречаются редуцированные элементы атрофированных миоцитов. Оставшиеся миоциты имеют удлиненную форму и цитоплазму, заполненную миофибриллами, а также содержат овальное ядро с глыбками хроматина у ядерной мембраны. Цитолемма имеет электронно-плотные участки, которые являются местами прикрепления эластических волокон, идущих от эластических мембран. В средней оболочке аллографта через 2 года после имплантации наблюдаются как интактные миоциты, так и фрагменты, в которых происходит замещение эластическими и коллагеновыми волокнами.

В субэндотелиальном слое через 1 и 2 года структура гладкомышечных клеток сохраняется. Более того, в них отмечается гипертрофия цитоплазмы и разрастание цитоплазматических отростков миоцитов, имеющих продольное направление в стенке сосуда. Имеется ряд соединений: между цитоплазматическими отростками миоцитов, цитоплазматическими отростками и телами миоцитов, а также между телами различных миоцитов. Кроме того, в 95% случаев (n = 19) тела и цитоплазматические отростки гипертрофированных миоцитов посредством эластических и коллагеновых волокон соединяются с эластическими мембранами (рис. 3).

электронограмма субэндотелиального слоя криосохраненного аллографта после 24 месяцев имплантации in vivo

Анализируя выявленные изменения, следует отметить, что несмотря на дегенерацию части миоцитов средней оболочки имплантированного in vivo криосохраненного аллографта, мышечно-эластический каркас поддерживается благодаря компенсаторной гипертрофии оставшейся части миоцитов средней оболочки, а также за счет изменений миоцитов субэндотелиального слоя. Сохранность мышечно-эластического каркаса обеспечивает адекватную функцию сосудистой стенки и препятствует образованию аневризм.

Среди эластических элементов средней оболочки возникают мелкие сосуды и капилляры. Через 1 год после имплантации в 85% случаев (n = 17) они незрелы и имеют вид неполноценных стенок из эндотелиоцитов и фибробластов. Просвет их не сформирован и представлен небольшим количеством гомогенного вещества. Через 2 года в 100% случаев ангиогенез завершается. Просвет новообразованных сосудов имеет продолговатую или щелевидную форму и заполнен гомогенным веществом (рис. 4).

электронограмма средней оболочки криосохраненного аллографта после 24 месяцев имплантации in vivo

Выводы

  1. Криоконсервация незначительно влияет на ультраструктуру аллографта, не приводя к выраженным изменениям в нем независимо от длительности пребывания ткани при температуре жидкого азота.
  2. Переход стенки аллографта на диффузное питание после имплантации в эксперименте вызывает сначала деструкцию в средней оболочке, а позднее стимуляцию образования капилляров и мелких сосудов сформированием новой vasa vasorum.
  3. Субэндотелиальный слой аллографта обеспечивается адекватным диффузным питанием и посредством изменений гладких миоцитов частично поддерживает мышечно-эластический каркас сосуда вместе с компенсацией оставшихся гладких мышечных клеток средней оболочки. Это обусловливает хорошую функцию стенки аллографта и препятствует образованию аневризм.

Дроздовский К. В. БелМАПО.
Опубликовано: "Медицинская панорама" № 8, октябрь 2003.

Наш сайт трудно найти в Яндексе, рекомендуем добавить его в закладки: