Фосфолипазная активность бронхоальвеолярных смывов


Фосфолипаза А2 (ФЛА2) легких – фермент катализирующий гидролиз сложноэфирной связи во втором положении глицерофосфолипидов, приводящий к высвобождению свободной жирной кислоты и формированию лизофосфолипида. Он присутствует в большинстве клеток и тканей млекопитающих. Предполагается активация фермента во время острого респираторного дистресс-синдрома взрослых, где он осуществляет деградацию фосфолипидов сурфактанта, состоящих на 65% из дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ); а также при астме и при других аллергических заболеваниях, при которых фосфолипаза А2 способствует усилению продукции эйкозаноидов. Тем не менее, роль фосфолипазы А2 в патологии легких окончательно не установлена.

Целью работы было изучение способности внутриклеточной и секреторной фосфолипаз А2, происходящих из альвеолярных макрофагов, к деградации дипальмитоилфосфатидилхолина. Тем самым предполагалось оценить потенциальную способность этих клеток к расщеплению сурфактанта и другого фосфолипид-содержащего материала, подлежащего удалению и локализованного в воздухопроводящих путях. Исследовалась активность этих ферментов в условиях гипертермии и гипоксии.

В эксперименте использовали 70 крыс (самцов) массой 180-200 г. Из бронхоальвеолярной лаважной жидкости выделяли альвеолярные макрофаги, которые инкубировали в нормальных условиях (37°, 21% O2) или при гипоксии (> 21% O2) в течение 1-20 ч. Прилипшие клетки соскребали, готовили клеточный гомогенат. Об активности секреторной фосфолипазы А2 судили на основании определения ферментативной активности в среде культивирования макрофагов. Субстратом для фосфолипазы А2 служили многослойные липосомы, приготовленные из хлороформного раствора липидного экстракта легких (100 мкл) и 0,025 μCi L-α-фосфатидилхолин ди[1-14C]дипальмитоила. Анализ продуктов гидролиза проводили с помощью тонкослойной хроматографии в системе растворителей хлороформ: метанолуксусная кислота: вода (65:43:1:4). Радиоактивность определяли с помощью жидкостного сцинтилляционного β-счетчика СБС-2 (Россия).

Aльвеолярные макрофаги обладают максимальной фосфолипазной активностью = щелочной среде (рН 9) в присутствии 5 мМ Са2+. Изучен широкий временной интервал, позволяющий сделать вывод, что максимальная удельная активность фермента (0,16 нмоль лизофосфатидилхолина / мин • мг белка) имеет место через 30 мин инкубации клеточного гомогената с субстратом. В течение последующа 4 ч происходило снижение удельной активности фермента, чтс можно связать с ингибирующим действием продуктов реакции (ЛФХ) на фермент. Максимальная активность секреторной фосфолипазы А2 (20% гидролиза, где 100% - вносимый в пробу дипальмитоилфосфатидилхолин) наблюдалась через 20 ч культивирования, что, вероятно, связано с индукцией гена этого фермента, которая происходит под воздействием продолжительной адгезии клеток на культуральных чашках.

Была изучена активность внутриклеточных и секреторных фосфолипаз А2 в условиях гипертермии и гипоксии. Установлено, что повышение температуры (37°-42° С) не влияет на фосфолипазную активность, что можно объяснить высокой термостабильностьк фермента.

Активность внутриклеточной фосфолипазы А2 при температуре 37° С в условиях гипоксии возрастала на 26% (10% O2) и 30,5% (5% O2) через 1 ч, на 67,4% (10% O2) и 70% (5% O2) через 20 ч инкубации по сравнению с активностью фосфолипазы А2 в условиях нормоксии (21% O2). Активность секреторной фосфолипазы А2 возрастала на 12,2% (10% O2), 21,4% (5% O2) через 1 ч культивирования, на 34,3% (10% O2) и 38,7% (5% O2) через 20 ч.

Полученные нами результаты показывают, что альвеолярные макрофаги способны участвовать в катаболизме сурфактанта и другого ДПФХ-содержащего материала в воздухопроводящих путях легких. В этом процессе принимают участие как внутриклеточные механизмы (цитозольная фосфолипаза А2), так и секреторный фермент. Обнаружено значительное увеличение фосфолипазной активности в условиях гипоксии - состояния, которое сопутствует многим заболеваниям легких.

Головач О. А.
Белорусский государственный медицинский университет.

(Опубликовано в журнале "Медицинская панорама" № 10, ноябрь 2004)

Наш сайт трудно найти в Яндексе, рекомендуем добавить его в закладки: