В современной медицине интенсивно применяются новые технологии для диагностики и лечения заболеваний. Для выявления возбудителей инфекции в последние годы в дополнение к традиционным микробиологическим и иммунологическим исследованиям все более широко используются методы молекулярной биологии.
В настоящее время амплификация нуклеиновых кислот полимеразной цепной реакцией (ПЦР) достаточно широко распространена в практической медицине. Данный метод незаменим в следующих случаях:
- диагностика инфекционных заболеваний
- диагностика опухолей:
- лейкемия и лимфомы
- рак молочной железы
- другие злокачественные новообразования
- диагностика генетических заболеваний
- идентификация личности:
- судебная медицина, криминалистика
- трансплантация органов и тканей
- определение отцовства.
В основе полимеразной цепной реакции лежит достраивание ДНК-матрицы по принципу комплементарности с помощью фермента ДНК-полимеразы, что носит название репликации или амплификации.
In vivo она включает несколько стадий:
- Денатурация ДНК.
- Образование коротких двухцепочечных участков ДНК.
- Синтез новой цепи ДНК.
Открытие у бактерий Thermis aguatis термостабильной ДНК-полимеразы, которая действует при температуре 70-72 °С, позволило осуществить репликацию ДНК in vitro и сделать процесс циклическим. При многократном повторении циклов репликации происходит увеличение числа копий фрагмента ДНК. Все это позволяет из единичных клеток микроорганизмов, содержащихся в анализируемом биологическом материале, получить необходимое количество ДНК для их идентификации. Чувствительность метода составляет 0,5-1 бактерия или вирусная частица на пробу.
Таким образом, полимеразная цепная реакция - это многократно повторяющиеся циклы синтеза специфической области ДНК в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинук-леотидфосфатов, солевого буфера и нуклеотидных праймеров, определяющих границы синтезируемого участка.
Каждый цикл синтеза (амплификации) состоит из 3-х этапов, протекающих в различных температурных режимах.
1-й этап. Денатурация ДНК - расплетение двойной спирали при температуре 93-95 °С в течение 30-40 с.
Одна из цепей (+) используется в качестве основной матрицы. У ее 5'-конца фиксируется фермент ДНК-полимераза, который обеспечивает построение из отдельных нуклеотидов второй цепи ДНК, комплементарной первой. Тоже самое,только в обратном направлении, происходит и на второй нити ДНК, но так как расплетение молекулы ДНК идет в обратном направлении, то новая цепь строится небольшими фрагментами, которые затем сшиваются. Для того чтобы фермент ДНК-полимераза начал свою работу, требуется наличие затравки, или праймера - небольшого одноцепочечного фрагмента ДНК, который, соединяясь с комплементарным участком одной из цепей родительской ДНК, образует стартовый блок для наращивания дочерней нити.
2-й этап. Отжиг - присоединение праймеров при температуре 50-65 °С в течение 20-60 с. Праймер - это химически синтезированная олигонуклеотидной природы затравка для полимеразной цепной реакции, определяющяя границы амплифицируемогоучастка ДНК-матрицы и комплементарная противоположным ее цепям.
При его разработке требуется найти фрагмент молекулы ДНК, который бы отличался генетической консервативностью и присутствовал только у интересующего нас вида микроорганизмов, при этом длина фрагмента должна составлять примерно 20 нуклеотидов.
Подбор праймера определяет специфичность: чем он длиннее, тем выше специфичность реакции. Средняя длина праймера - 18-20 нуклеотидов. После каждого цикла синтезируется по 2 ампликонадлиной 200-1000 нуклеотидов. Проделать эту работу помогают специальные компьютерные программы. В соответствии с найденной последовательностью нуклеотидов и синтезируется праймер. Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующей последовательности нуклеотидов на противоположной цепи ДНК.
Поскольку наращивание дочерних нитей ДНК может идти одновременно на обеих цепях материнской ДНК, то для работы ДНК-полимеразы на второй цепи тоже требуется свой праймер. Таким образом, в реакционную смесь вносятся два праймера. Фактически праймеры, присоединившись к противоположным цепям молекулы ДНК, ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно удвоен или амплифицирован. Такие фрагменты ДНК называются ампликонами. Длина ампликона может составлять несколько сот нуклеотидов. Меняя пару праймеров, мы можем переходить от анализа одного возбудителя к анализу другого.
3-й этап. Элонгация - достраивание цепей ДНК при температуре 70-72 °С в течение 20-40 с. Комплементарное достраивание цепей ДНК идет в направлении от 5'-конца к 3'-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служит вносимый дезоксирибонуклеотидфосфат. Этот процесс катализируется ферментом Tag-полимеразой. Образовавшиеся в первом цикле синтеза новые ДНК служат исходным материалом для второго цикла, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона) и т.д.
Накопление ампликонов происходит по формуле 2n, где n - число циклов амплификации. Количество циклов может быть 25-40, в среднем 30. Следовательно, если в начальном растворе находилась одна ДНК, то после 30 циклов их будет 108. Этого количества достаточно для достоверной идентификации методом электрофореза в агаровом геле.
Если в растворе не окажется ни одной молекулы ДНК с участком, комплементарным внесенным праймерам, даже несмотря на то, что в растворе будет плавать миллион других молекул ДНК, реакция полимеразной цепной реакции не произойдет.
В случае диагностики некоторых инфекций, например, вирусного гепатита В, С, D, необходимо большее число ампликонов, а значит, и циклов (40-45).
Следует отметить, что данный метод позволяет диагностировать как ДНК-содержащие микроорганизмы с помощью фермента ДНК-зависимой ДНК-полимеразы (гепатит В), так и РНК-содержащие - с РНК-зависимой ДНК-полимеразой (гепатит С).
Весь технологический процесс с использованием полимеразной цепной реакции осуществляется в виде трех основных процедур: пробоподготовка клинических образцов; проведение самой полимеразной реакции, направленной на умножение (амплификацию) фрагментов ДНК биологического возбудителя; детекция продукта ПЦР, т.е. оценка результата.
Подготовка исследуемой пробы материала - это стадия выделения и преципитации ДНК, что обеспечивает концентрирование обнаруживаемой ДНК инфекционного агента в минимальном объеме жидкости, используемой в полимеразной цепной реакции. В настоящее время применяется несколько способов пробоподготовки. Процедура включает лизис микроорганизмов и экстракцию ДНК. С целью разрушения клетки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода диктуется природой микроорганизма, точнее, его клеточной стенки. Для экстракции ДНК используют два способа. Во-первых, применяют фенольно-хлороформную экстракцию, при которой достигается хорошая очистка ДНК, но происходят большие потери нуклеиновой кислоты. Другой метод основан на использовании сорбентов. Подготовка материала при этом занимает меньше времени и более проста в исполнении.
Во время процедуры в образец, содержащий ДНК возбудителя, в небольшую пробирку с компонентами, обеспечивающими протекание полимеразной реакции, вносится два вида праймеров, два энзима (Tag-полимераза и N-урацилгликолаза) и четыре вида нуклеотида - А, Г, Ц, У. Для проведения полимеразной реакции используется специальное устройство (термоциклер или ДНК-амплификатор), позволяющее автоматически, по определенной программе, изменять температурный режим реакционной смеси. В первом цикле ПЦР образец нагревается до температуры 94 °С для разделения двух комплементарных нитей ДНК. Затем температура снижается до 40-60 °С, при которой праймеры присоединяются к единичной цепи ДНК, после чего температура вновь поднимается до 72 °С (при этом наиболее выражена активность полимеразы). Весь цикл с изменением температуры продолжается менее 3-х мин.
Результаты ПЦР анализируют с использованием метода иммуноферментного анализа, электрофореза в плоском агаровом геле. Его окрашивают бромистым этидием, и полосы анализируют с последующим фотографированием. При этом расстояние пробега полосы исследуемой пробы, соответствующее таковому в положительном контроле, свидетельствует о синтезе фрагмента ДНК возбудителя.
=================
Вы читаете тему:
Полимеразная цепная реакция. Сущность метода, его преимущества и возможности.
1. Сущность ПЦР и циклы синтеза ДНК.
2. Преимущества и применение полимеразной цепной реакции.
Костюк С. А. БелМАПО.
Опубликовано: "Медицинская панорама" № 9, ноябрь 2003.